Молекулярные векторы, используемые в генетической инженерии

Вектор (англ. vector) – это «переносчик инфекции». Данное понятие применяется в разнообразных случаях. Примеры векторов из разных областей биологии:

1) кровососущие насекомые выступают как векторы патогенных микроорганизмов и вирусов, вызывающих болезни позвоночных животных;

2) насекомое из рода Sire.х – это вектор, переносящий пропагулы базидианального гриба Aniylostereum, вызывающего гниль ствола хвойных деревьев.

Молекулярный вектор – это молекула ДНК, в которую возможна встройка фрагмента чужеродной ДНК. Она способна переносить данный фрагмент в своем составе в реципиентные клетки, самостоятельно реплицироваться и стабильно поддерживаться в реципиентных клетках, либо встраиваться в геном хозяина и также стабильно в нем поддерживаться.

По другому определению, молекулярные векторы – это гибридные молекулы ДНК, несущие искусственно встроенный фрагмент, представляющий тот или иной интерес, и способные амплифицироваться (размножаться) в живых клетках отдельно от основного генома хозяина или встраиваться в него.

Общие представления о нуклеиновых кислотах

ДНК – это биологический гетерополимер. В обычном состоянии первичная структура ДНК представляет собой двойную спираль, состоящую из двух длинных полимеров, закрученных вокруг обшей оси. Ширина спирали составляет 2-2,6 нм. Две цепи ДНК, образующие спираль, по своей химической структуре являются антипараллельными, т.е. ориентированы в противоположные стороны. В живой клетке спираль образует компактизированную структуру, в которой ДНК намотана на хроматиновые белки или гистоны. Остов ДНК образован сахарофосфатными группами, соединенными сложноэфирными связями. Сахарид, входящий в состав ДНК, является пентозой, т.е. 5-углеродным сахаром.

Единицы или мономеры ДНК – это нуклеотиды.

Основание, соединенное с сахаридом, образует нуклеозид, а нуклеозид, соединенный с остатком фосфорной кислоты в позиции пентозного кольца 5’, образует нуклеотид.

В результате репликации образуется две идентичные копии двойной спирализированной молекулы ДНК.

Конец молекулы, на котором имеется свободная гидроксильная группа, находящаяся в позиции 3’ пентозного кольца, называется три-штрих, или три-прим концом. Противоположный конец, на котором имеется остаток фосфорной кислоты, присоединенный к углеродному атому 5’ дезоксирибозы, называется пять-штрих, или пять-прим концом.

В рибонуклеиновой кислоте (РНК) в остов молекулы входит сахарид рибоза, у которого, в отличие от дезоксирибозы, в позиции 2’ пентозного кольца имеется гидроксильная группировка.

Основания в составе ДНК делятся на пурины и пиримидины. Пуриновые основания имеют 2 кольца, состоящие из атомов C и N, а пиримидины – одно кольцо. К пуринам принадлежат аденин и гуанин, к пиримидинам – цитозин и тимин, а также уроцил, который заменяет тимин в РНК.

Метилирование – это способ модификации нуклеотидов в живых системах. НДНК «схлопываются» подобно застежке-молнии. Матричные процессы и центральная догма молекулярной биологии Центральная догма молекулярной биологии описывает путь передачи генетической информации в клетке по генеральной схеме ДНК / матричная ГНК / белок. Матричная РНК (мРНК) называется еще мессенджер-PHК. Главныаиболее распространенный пример метилирования – это 5-метилцитозин. В двойной молекуле ДНК нуклеотиды образуют комплиментарные (взаимодополняющие) пары пурины-пиримидины, объединенные водородными связями. Между А и Т образуется 2 водородные связи, между G и С – 3. По этой причине пары G-С связаны более прочно.

В векторных системах ДНК используется как в одноцепочечной , так и двухцепочечной форме. Одна из цепей, кодирующая белок, называется смысловой, а комплиментарная ей – антисмысловой.

При температуре 90-95 градусов водородные связи между нитями ДНК рвутся, и двунитевая ДНК разделяется на две однонитевые молекулы. Этот процесс называется денатурацией, или плавлением. Если молекулы находятся в растворе, то при понижении температуры они ассоциируются вновь, благодаря комплиментарным взаимодействиям между нуклеотидами. Этот процесс называют гибридизацией. При этом нити ДНК «схлопываются» подобно застежке-молнии. Матричные процессы и центральная догма молекулярной биологии Центральная догма молекулярной биологии описывает путь передачи генетической информации в клетке по генеральной схеме ДНК / матричная ГНК / белок.

Матричная РНК (мРНК) называется еще мессенджер-PHК.

Главными путями передачи генетической информации являются:

— ДНК — ДНК (репликация ДНК);

— ДНК > мРНК (транскрипция у прокариот);

— ДНК — пре-мРНК — зрелая мРНК (транскрипция и созревание РНК );

— мРНК — белок (трансляция).

Специальные пути передачи информации:

— мРНК — ДНК (обратная транскрипция, для РНК-содержащих вирусов или ретровирусов);

— РНК — РНК (репликация РНК).

Репликация ДНК у про- и эукариот идет с помощью набора специальных ферментов. Главнейшие из них – ДНК-полимеразы, которые достраивают комплиментарную цепь на основе одноцепочечной молекулы, используя свободные мононуклеотиды в качестве строительных блоков.

Транскрипция происходит с участием фермента транскриптазы. Транскрипция и созревание мРНК у эукариот происходят в клеточном ядре, в частности на молекулярных машинах биосинтеза белка – рибосомах.

Экспрессия гена – это процесс, при котором заложенная в гене информация используется для синтеза функционального продукта. Функциональным продуктом может являться:

1) белок;

2) рибосомальная РНК;

3) тринспортная РНК;

4) малая ядерная РНК.

Последний из видов РНК принимает участие в сплайсинге и в процессе формирования рРНК. В случае применения векторов наибольший практический интерес представляет экспрессия белок-кодирующего гена.

Функции и главнейшие типы векторов

Предпосылки разработки и применения молекулярных векторов в генной инженерии и биотехнологии.

1. Открытие нуклеиновых кислот и генетического кода;

2. Открытие внехромосомных элементов у про- и эукариот – плазмид;

3. Открытие вирусов и в особенности механизмов встраивания вирусной ДНК в геном хозяина;

4. Разработка методов выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных плазмид и неповрежденной ДНК вирусов;

5. Раскрытие механизмов проникновения чужеродной ДНК в клетки;

6. Открытие ферментов, обеспечивающих репликацию и модификацию ДНК.

Назначение векторов:

В фундаментальной науке векторы служат для изучения отдельных генов и целых геномов путем их клонирования и последующего сиквенса, для изучения функций генов и молекулярных механизмов их экспрессии. В инженерии векторы используются с целью создания генно-модифицированных организмов продуцентов.

Главнейшие типы векторов (по назначению):

1. Клонирующие векторы – служат для наработки большого количества копий встроенного фрагмента ДНК (например, с целью его последующего сиквенса – расшифровки последовательности);
2. Экспрессирующие векторы – служат для получения чужеродного белка в организме-хозяине (организме-продуценте); векторы, обеспечивающие правильную и эффективную экспрессию чужеродных генов в клетках. Встроенный в вектор ген не только амплифицируется, но на его основе происходит образование мРНК и затем белков. Экспрессирующие векторы используются для создания штаммов микроорганизмов, продуцирующих чужеродный белок в повышенных количествах.
3. Нацеленные векторы – служат для введения дефектного гена в геном изучаемого oрганизмa с целью выявления фенотипического проявления генов. Вектор, используемый для инактивации какого-либо гена при генетических исследованиях определенных организмов, называют нацеленным.

По поведению относительно генома хозяина векторы делят на интегративные и неинтегративные. Если вектор обеспечивает встройку чужеродной ДНК в геном клетки, то он называется интегративным.

Молекулярный вектор должен обладать:

1) участком, определяющим начало репликации;

2) сайтом для встройки чужеродной ДНК;

3) селективным маркером.

Необходимые свойства клонирующих векторов:

1) вектор должен нести нуклеотидную последовательность, которая отвечает за автономную репликацию данной молекулы в определенном типе клеток;

2) не должен терять репликативных свойств даже при встройке чужеродного фрагмента ДНК;

3) должен иметь как можно малое число мест расщепления определенной рестриктазой, лучше один сайт или локус рестрикции;

4) должен содержать 1 или несколько генетических маркеров, по которому может быть произведен отбор клоном, т.е. если вектор успешно внедрился в клетку, эту клетку необходимо отобрать по хорошо различимому признаку и размножить, а затем произвести молекулярное клонирование;

5) должен реплицироваться с образованием повышенного числа копий в клетке.